Ako predchádzať bakteriálnej kontaminácii semena
Početné genetické, zdravotné alebo environmentálne faktory boli asociované so zníženou plodnosťou hovädzieho dobytka. Rovnako aj bakteriálna kontaminácia môže prispieť k redukcii pôrodnosti ako aj ku zdravotným komplikáciám.
Prítomnosť baktérií v ejakuláte môže prameniť z vnútorného bakteriálneho osídlenia samčieho urogenitálneho traktu, počnúc semenníkmi, cez pohlavné žľazy, semenovod, respektíve močovú trubicu až po predkožku a penis. Všadeprítomné mikróby majú dostatok šancí kontaminovať semeno aj počas zberu, spracovávania a uchovávania. Umelá vagína, laboratórne sklo a príslušenstvo sú najbežnejším zdrojom bakteriálnej kontaminácie počas spracovania. Použitie inseminačnej dávky, ktorá je mikrobiologicky aktívna môže nielen znížiť početnosť narodených, ale aj prenášať ochorenia medzi zdravou populáciou.
Prvé štúdie zaoberajúce sa bakteriálnym spoločenstvom, ktoré osídľuje ejakulát býkov vznikali v štyridsiatych a päťdesiatych rokoch minulého storočia. Gunsalus a kol. (1941) identifikovali baktérie z rodov Corynebacterium, Pseudomonas, Staphylococcus, z triedy Bacilli a druhu Escherichia coli. Každá tretia vzorka obsahovala viac ako 100000 kolóniu-tvoriacich jednotiek na mililiter (KTJ/ml). Pre porovnanie – osídlenie najlepších vzoriek dosahuje od niekoľkých jednotiek až po desiatky KTJ/ml. Pojem „bakteriospermia“ bol zavedený v andrologickej diagnostike mužov. Definuje ejakulát, ktorý obsahuje viac ako 1000 KTJ/ml. U býkov nie je jasne definované množstvo KTJ/ml, ktoré by charakterizovalo bakteriospermiu. Výsledky súčasných štúdií však naznačujú, že fyziologická koncentrácia baktérií sa pohybuje do 103– 106. Nedávna štúdia ukázala, že zapojenie imunitného systému za prítomnosti baktérií v urogenitálnom trakte môže mať negatívny dopad na štruktúru a funkčnosť spermií. Prítomnosť baktérií v urogenitálnom trakte vyvoláva infiltráciu imunitných buniek, ktoré priamo produkujú voľné kyslíkové radikály ako súčasť mechanizmu boja proti rastu a rozmnožovaniu baktérií. Zvýšená produkcia týchto kyslíkových radikálov spôsobuje oxidatívny stres, na ktoré spermie nie sú schopné relevantne reagovať antioxidačnou odpoveďou. Množstvo antioxidačných enzýmov je počas spermiogenézy (tvorby spermií) redukované. Membrána bunky obsahuje vysoké koncentrácie nenasýtených mastných kyselín, ktoré sú obzvlášť citlivé na voľné radikály. Preto vplyvom oxidatívneho stresu dochádza k zmenám štruktúry spermií, klesá ich pohyblivosť až nastáva smrť spermií.
Baktérie však dokážu aj priamo uvoľňovať spermatotoxické látky. Niektoré z nich sa dokážu priamo „nalepiť“ na povrch spermií alebo spôsobiť zhlukovanie spermií, čím sa stanú nepohyblivými. Dodržanie prísnych hygienických štandardov je teda nevyhnutnou súčasťou pred a počas odberu ejakulátu, ktoré dokážu významne zredukovať počet baktérií v semene. Svetová organizácia pre zdravie zvierat (OIE) požaduje aspoň raz ročne testovanie býčích ejakulátov na prítomnosť pôvodcov brucelózy, bovinnej tuberkulózy, BVD, Campylobacter fetus subsp.venerealis, katarálnej horúčky oviec, Trichomonas foetus, infekčnej bovinnej rinotracheitídy a infekčnej postulárnej vulvovaginitídy za účelom udržiavania zdravia zvierat v centrách pre umelé oplodnenie na úrovni, ktorá umožňuje medzinárodnú distribúciu inseminačných dávok so zanedbateľným rizikom infekcie zvierat alebo ľudskými patogénmi prenosnými spermiami. Napriek striktným hygienickým štandardom počas odberu, dokážu baktérie kontaminovať semeno prostredníctvom umelej vagíny, laboratórneho skla, vybavenia, riedidla a dokonca aj prostredia. Niektoré podmienečné patogény ako napríklad Staphylococcus, Streptococcus, Mycoplasma, Pseudomonas, Corynebacterium a Bacillus boli objavené aj u klinicky zdravých býkov.
Dodržiavanie nasledovných odporúčaní významne zníži pravdepodobnosť kontaminácie semena bežnými potenciálnymi patogénmi:
- Podlaha by mala byť čistá a poskytovať bezpečnú oporu – je vhodné sa vyhnúť prašnej podlahe
- Zadná časť fantóma alebo živého zvieraťa by mala byť udržiavaná v čistote pred každým odberom a po odbere dezinfikovať. Vhodné je aj použitie jednorazových plastových prikrývok.
- Ruka osoby, ktorá odoberá semeno, by sa nemala dostať do kontaktu s penisom zvieraťa. Pri každom odbere je nutné meniť jednorazové rukavice.
- Čistenie umelej vagíny po každom odbere je nevyhnutné. Treba ju rozobrať, umyť všetky časti, opláchnuť, vysušiť a chrániť pred prachom. Vnútro umelej vagíny a silikónový kužeľ je nutné dezinfikovať schálenými dezinfekčnými prostriedkami: alkohol, etylénoxid alebo para. Umelá vagína by mala byť uskladnená v skrini, ktorá sa pravidelne čistí a dezinfikuje.
- Lubrikant musí byť čistý a aplikovaný maximálne do 2/3 dĺžky umelej vagíny
- Po odbere treba s umelou vagínou zaobchádzať opatrne, aby nedošlo k zmiešaniu nečistôt, prípadne lubrikantu s obsahom zberného vrecka.
- Na po sebe dva nasledujúce ejakuláty je vhodné použiť dve rôzne umelé vagíny a to aj v prípade, ak zviera vložilo penis a nedošlo k ejakulácii.
- Odberné skúmavky by mali byť sterilné: je vhodné použiť buď jednorazové alebo sterilizované autoklávovaním alebo zahrievaním v sušiarni na 180°C po dobu aspoň 30 minút. Skúmavky uchovávame po sterilizácii uzavreté, aby sme predišli kontaminácii z okolitého prostredia.
- Po odbere by mala byť skúmavka alebo zberné vrecko pripojené ku kužeľu, kým sa semeno neprenesie do laboratória.
K spracovaniu a príprave semena k mrazeniu dochádza v laboratóriu. Pred samotným spracovaním sa musí odobraná vzorka semena vyhodnotiť, aby sme zistili, či vôbec má význam ďalej túto vzorku použiť. Makroskopické a mikroskopické hodnotenie spermií musí byť vykonané do 5 minút od odberu, počas ktorých je semeno udržiavané pri 37 °C. Makroskopicky sa hodnotí vzhľad, objem, prípadná prítomnosť nečistôt. Mikroskopom sa vyšetruje najmä pohyblivosť, prípadne progresívna pohyblivosť (zastúpenie najrýchlejších spermií) a ich koncentrácia. Percento nepohyblivých spermií by nemalo prekročiť 30% z celkového množstva. Vyššie percento nepohyblivých spermií môže naznačiť u pohlavne dospelého jedinca isté ochorenie.
Napriek tomu, že laboratórium nie je sterilným prostredím, všetky nádoby (banky, kadičky) musia byť vopred sterilizované. Rovnako aj všetky roztoky, vrátane destilovanej alebo demineralizovanej vody sa vopred autoklávujú (121 °C počas 30 minút), alternatívne sa môžu sterilizovať filtráciou cez filter s pórmi o veľkosti 0,22 µm. Väčšina baktérií sú veľké 1-10 µm a preto je možné sa ich takouto filtráciou zbaviť. Ako prídavok do zmrazovacieho riedidla sa však často používa živočíšna bielkovina – najčastejšie vaječný žĺtok alebo mlieko. Často práve tieto prídavky môžu byť zdrojom bakteriálnej kontaminácie, prípadne podporovať rast už kontaminovaného semena. Zahriatie mlieka na 92 °C počas 3-5 minút by malo zabrániť kontaminácii patogénmi. Používanie vajec z tzv. SPF chovu (Specific Pathogen Free) alebo použitie sušeného žĺtka je vhodnou alternatívou na zredukovanie možného bakteriálneho znečistenia.
Antibiotiká a ich budúcnosť v oblasti umelej inseminácie
Z pohľadu legislatívy sú nevyhnutnou súčasťou riedidla látky s baktericídnym účinkom – antibiotiká. Na každý mililiter riedidla je nutné pridať 250 µg gentamicínu, 50 µg tylozínu a kombináciu linkomycín/spektinomycín (150/300 µg). Alternatívne možno použiť 500 IU (z angl. International Units), 500 µg streptomycínu a linkomycín/spektinomycín (150/300 µg). Ďalšou možnou kombináciou je použitie amikacínu (75 µg) a divekacínu (25 µg).
Celosvetovo je tendencia používať širokospektrálne antibiotiká v semenných riedidlách. V rôznych kombináciách už pri nízkych koncentráciách znižujú riziko spermatotoxicity. Ročná spotreba riedidiel sa odhaduje na vyše 4 milióny litrov v Európe, pri celosvetovom meradle približne 14 miliónov litrov. Hoci v posledných rokoch došlo k nárastu antimikrobiálnej rezistencie semenných patogénov voči všetkým triedam antibiotík, ktoré sa používajú v súvislosti s uchovávaním spermií, výskyt rezistentných druhov je špecifický vzhľadom na jednotlivé inseminačné stanice. Posledné roky naznačujú, že vývoj nových alternatív ku konvenčným antibiotikám bude nevyhnutnou súčasťou aj v oblasti umelej inseminácie. Potenciálne aditíva však musia spĺňať náročné kritériá: širokospektrálne použitie, absencia spermatotoxicity, bez interferencií s plodnosťou, vysoko stabilné, aktívne pri bežných teplotách skladovania spermií, s nízkym potenciálom vyvolať antimikrobiálnu rezistenciu, ľahko aplikovateľné a finančne dostupné. Najnovšie štúdie ukazujú, že využitie tzv. antimikrobiálnych peptidov môže byť sľubnou alternatívou. Ich hlavný mechanizmus účinku je založený na narušení bakteriálnej membrány vďaka elektrostatickej interakcii medzi kladne nabitým peptidom a kyslou bakteriálnou membránou. Veľkou kategóriou v rámci odhaľovania antimikrobiálnej aktivity sú rastlinné extrakty a esenciálne oleje. Niektoré ich zložky dokážu významne znížiť tvorbu energie v baktériách avšak mnoho z nich môže pôsobiť spermatotoxicky. Samotné baktérie však produjú tzv. bakteriocíny, ktorými bojujú proti konkurenčným baktériám. Ukázalo sa, náhrada za gentamicín v
Poďakovanie
Táto publikácia vznikla vďaka podpore v rámci Operačného programu Integrovaná infraštruktúra pre projekt: Tvorba nukleových stád dojníc s požiadavkou na vysoký zdravotný status cestou využitia genomickej selekcie, inovatívnych biotechnologických metód a optimálneho manažmentu chovu, NUKLEUS 313011V387, spolufinancovaný zo zdrojov Európskeho fondu regionálneho rozvoja.
